分析前，用流动相梯度洗脱程序的初始浓度，冲洗系统至基线平稳，运行一次完整的分析程序（即：对标准溶液进样检测），待系统稳定后，再进行检测，如果较长时间未使用，可能需要多运行几次完整的分析程序，得到重现的色谱图后再进行检测，由于欧盟76/769/EEC号环保指令要求检测的都是机体复杂的样品，检测完全后按色谱柱的维护项下“4、避免强保留物质在色谱柱保留”多冲洗色谱柱，其它维护和再生同反相柱。

色谱柱的保存：

短时间保存：

间隔不超过四天，色谱柱按平时维护程序冲洗至基线平稳，反相色谱柱保存在不带有缓冲盐、离子对试剂的有机相/水溶液中，有机相不低于20%；正相色谱柱正相使用保存在纯正己烷中，反相使用保存在纯有机溶剂中；并将随柱的塑料堵头旋紧密封。

长期保存：

反相色谱柱保存在80%甲醇或80%乙腈水溶液中；正相色谱柱正相使用保存在纯正己烷中，反相使用时需将柱内存储液用异丙醇置换，最后用正己烷保存；最好将色谱柱从仪器上取下，并将随柱的塑料堵头旋紧密封。

色谱柱的维护：

1、柱压升高是每个色谱工作者都很头疼的问题，长时间使用造成柱压的缓慢升高通常是正常现象；短时间甚至是突然的柱压升高通常是异常升高，排除仪器的故障，确定是色谱柱自身原因，一般有以下几点：

1）柱头的过滤筛板污染（固体颗粒物堵塞、强保留物质累积）：

解决方法：

a、在柱前端加上在线过滤器或保护柱，用甲醇/水=20/80 1.0ml/min反向冲洗色谱柱180min；

b、在柱前端加上在线过滤器或保护柱，反向使用；

c、可将柱头打开，将色谱柱头中过滤筛板取出，在稀硝酸溶液内超声清洗20min，纯水超声清洗20min，最后用甲醇超声清洗20min，重新装入色谱柱；

2)柱头填料污染（固体颗粒物堵塞、强保留物质累积）：

解决方法：

a、用可以溶解污染物的溶剂较长时间（180min）反向冲洗色谱柱；

b、可将柱头打开，小心取出被污染的填料，用相同的填料重新装入修复；

3)pH使用不当造成的损伤：

解决方法：pH使用不当造成固定相的缺失或塌陷，很难使色谱柱恢复，只能更换色谱柱。

2、使用保护柱和在线过滤器：

样品和流动相中不能完全过滤掉及泵磨损、密封圈和管路老化产生的固体颗粒物，进入到色谱柱中就会堵塞筛板，导致柱压升高，柱效下降，保护柱和在线过滤器上都有筛板，孔径与分析柱的孔径相同，能阻止颗粒物到达色谱柱，在分析故障中，柱压升高占很大比例，因此建议您在色谱柱前端加上在线过滤器或者保护柱；

3、缓冲盐的正确使用：

缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，其使用不当会析出，加快泵柱塞杆和密封圈，流通阀的磨损，堵塞色谱柱头筛板，填料基质上的微孔和颗粒间的间隙，使填料板结柱压升高，阻碍基质上键合相的碳链自由舒展，使色谱柱保留能力下降，柱效降低，缩短其使用寿命，缓冲盐析出后很难去除，因此正确的使用缓冲盐对延长色谱柱的使用寿命非常重要，具体方法如下：

“使用前过渡! 使用后冲洗!”

1）、等度条件：分析前后用过渡流动相冲洗柱体积不少于20-30个柱体积，或分析完成后用过渡流动相以0.2ml/min（根据柱规格调整）冲洗过夜；

2）、梯度条件：分析前，用与初始流动相组成相同的流动相以分析流速冲洗色谱柱不少于20-30个柱体积，分析后，用该过渡流动相冲洗色谱柱不少于20-30个柱体积，且梯度尽量平缓，避免缓冲盐析出。

过渡流动相：有机相和水相的比例和分析流动相中两相比例一致，或者水相比例高于分析流动相，绝对不含缓冲盐。

3）、缓冲盐析出：具体补救方法见“色谱柱常见问题和解决方法-3、缓冲盐结晶析出解决方法”。

4、避免强保留物质在色谱柱保留：

强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，是一个缓慢的过程，一段时间后会对样品成分产生额外的保留行为，引起峰变宽，拖尾，使柱效下降，保留时间变化，到一定程度时会导致柱压升高，对许多样品特别是复杂样品很难判断其是否含有强保留物质，因此要预防这一切的方式，坚持每天分析完成后用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上。

清洗方法：

1）、未使用缓冲盐，每天分析完成后用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上；

2）、使用缓冲盐，用上述方法去除缓冲盐后，用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上；

3）、补救方法：水 — 乙腈 — 异丙醇（或氯仿）— 乙腈 — 水，每一步需要冲洗不少于30个柱体积。

注意：不要轻易打开柱头，因为柱头一旦打开，很难恢复到新柱的水平，因为柱头打开而造成的检测后果，客户自行负责。

色谱柱再生：

色谱柱作为液相色谱中的核心检测部件，会随着使用时间和进样次数的增加，出现异常的色谱现象，如果一根色谱柱的柱效太低或者柱压太高，通常认为该色谱柱使用寿命已到，为了延长色谱柱的使用寿命，除了完全按照每一款色谱柱的性能使用以外，适当的色谱柱再生是很有效的途径：

1、氰基（CN）色谱柱的维护和再生：

CN基柱属于中等极性的固定相，作反相色谱时操作和维护和C18柱完全相同，增加水相比例，可以促进样品的洗脱，但是CN属于短链的键合相，水相比例太高易使CN键水解，尤其在色谱柱pH耐受范围以外，极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用，需要按以下程序用15个柱体积溶液冲洗，如下： 95%水/5%乙腈 — THF四氢呋喃 — 95%乙腈/5%水并保持95%乙腈/5%水继续冲洗，以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。在pH耐受范围条件使用时，也比较伤柱子，要注意冲洗，可以参照上述方法，时间可适当减少。柱子使用一定时间后，柱效下降，需要老化再生，再生时用15个柱体积的下列溶液冲洗： 95%水/5%乙腈— THF四氢呋喃— 95%乙腈/5%水再走流动相即可；

CN柱用于正相时，当柱子使用一定时间后，柱效下降，可清洗一下恢复柱性能，再生时用10个柱体积的下列溶液冲洗：氯仿 — 异丙醇 — 二氯甲烷再走流动相即可；

CN柱最理想的pH范围在pH 2.0-5.0；

CN柱的保存，可用异丙醇或正己烷保存（保存溶剂中不能含水），两端封好，流动相改变时要注意过渡和两相之间的互溶。

2、反相柱的再生：

反相色谱柱是使用最普遍的色谱柱之一，除按照以上内容使用以外，必要的再生清洗可以有效的延长色谱柱的使用寿命，用下列每种溶剂20~30个柱体积冲洗：

100％甲醇 – 100％乙腈 – 75％乙腈/25％异丙醇 – 100％异丙醇 – 100％二氯甲烷 – 100％正己烷 – 100％异丙醇 – 100％甲醇

3、正相色谱柱的再生：

正相氨基柱的键合官能团氨丙基要比C18,C8柱的键合官能团易水解，所以其使用寿命稍短，特别是使用反相条件时，要严格控制PH值范围，PH值越低流动相中水的比例越高越易发生水解。

注意：所有试剂都要严格脱水

用氨基柱检测酸性物质可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，一定程度上改变对某类的分析物保留性质或表现为柱效下降，再生建议是：

用5-10个的柱体积的含0.5-1.0％NH₃的50-50乙腈-水溶液冲洗（冲洗后用不含碱的流动相洗去多余的氨），分析酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1％。

填料被样品中杂质累积污染，色谱柱表现行为柱压增高柱效降低等，
依次用：

甲醇 – 异丙醇 – 氯仿 – 正己烷 – 氯仿 – 异丙醇 – 甲醇冲柱子

（各以0.5ml/min的流速，20个柱体积），再换流动相

NH2柱用于反相条件时，NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用需要清洗一下，需要用10个柱体积溶液冲洗，也是正相条件下使用色谱柱的再生，如下：

95％水/5％乙腈 – THF四氢呋喃 – 95％乙腈/5％水并保持95％乙腈/5％水继续冲洗，以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。

反相使用氨基色谱柱的再生（每种淋洗液不少于30个柱体积）：

NaOH（pH 9.0）– 色谱纯水冲 – 平衡到流动相或者适合保存的溶液

其它正相柱（硅胶柱，Diol柱）的再生（每种淋洗液不少于20个柱体积）：

正己烷 – 异丙醇
正相柱除水：

含2.5 % 二甲氧基丙烷（dimethoxypropane）和2.5 % 冰醋酸的正己烷冲洗30个柱体积。